| 成果名称： | 活血药单体对血小板与肿瘤细胞的促转移协同作用的影响 |
| 鉴定编号： | 2003057 |
| 完成单位： | 中国中医研究院广安门医院 |
| 所属领域： | 中医中药 |
| 成果摘要： |
1．肿瘤患者与正常人血小板表面抗原表达异同的临床观察
1．1 主要研究内容及研究方法采用荧光标记的单克隆抗体，在国内外率先采用流式细胞术对 181 例实体肿瘤患者（食管癌7例，肾癌5例，肝癌17例，肺癌74例，胰腺癌7例，胃癌21例，大肠癌15例，乳腺癌24例，子宫体癌1例，非何杰金氏淋巴瘤2例，前列腺癌1例，卵巢癌1例，黑色素瘤1例，原发灶不明的转移癌2例，膀胱癌1例，脑瘤1例，胸壁恶性纤维组织细胞瘤1例。其中I、II期46例，III、IV期135例）和50 例非肿瘤患者血小板表面表达的粘附分子CD9、CD31、CD41、CD42a、CD36、TSP、 CD62、CD63的表达进行了检测。
1．2 主要研究成果对正常人、早、晚期肿瘤患者血小板表面抗原表达状况的分别对比发现，CD42a+CD41+血小板数目在早、晚期肿瘤患者、正常人相互间没有差别；但在CD42a 的表达上晚期肿瘤患者最低，早期患者次之，正常人最高，说明随着病情加重，CD42a的表达也随之降低；CD36+TSP+ 血小板数目晚期患者最高，早期患者次之，正常人最低，相互之间均有统计学差异，CD36+TSP+血小板的CD36表达在早晚期患者间及早期患者与正常人之间也没有差异，但在晚期患者与正常人之间存在差异；CD36+TSP+血小板TSP的表达以晚期患者最高，早期患者次之，正常人最低，在早、晚期患者间，晚期患者与正常人间均有统计学意义的差异，在早期患者与正常人间可能也有差异；CD36+TSP-血小板数目在晚期肿瘤患者与正常人之间差别明显，晚期肿瘤患者高于正常人；其中CD36的表达在早期患者与晚期患者间，晚期患者与正常人之间的差别都很明显，晚期患者高于早期患者，早期患者高于正常人，但早期患者的值与正常人比差异并不明显；CD9+、CD31+ 血小板数在早期与晚期患者之间的差别不明显，但早、晚期患者的值均比正常人要高，有统计学差异；CD9+、CD31+血小板表达的CD9和CD31的荧光强度在正常人、早晚、期患者间未显示差别；CD63-CD62+、CD63+CD62+血小板的数目在晚期患者、早期患者与正常人间逐次降低，相互之间均有统计学差异；CD63+CD62- 血小板数目在晚、早期及正常人间也逐次降低，但在早、晚期患者间还没有明显的差别，但早、晚期患者分别与正常人有明显差别；血小板表达的CD62 和 CD63的荧光强度分别在早、晚期肿瘤患者、正常人相互间未显示出统计学意义上的差别。综上所述，正常人、早期肿瘤患者、晚期肿瘤患者相互之间在血小板粘附分子的表达和激活状况上有明显差别，其异常程度基本上有晚期患者＞早期患者＞正常人的规律。肿瘤患者，尤其是中晚期肿瘤患者血小板表面粘附分子除CD41外，所检测的CD42a、CD36、TSP、CD9、CD31、CD62、CD63阳性血小板的数目或表达强度有明显改变，血小板粘附和释放增加，处于全面激活状态。
1．3 研究成果的科学意义和应用前景肿瘤患者血小板粘附分子表达的增加，血小板 a－颗粒和溶酶体的丰富释放产物，不仅为血小板粘附和聚集提供了所需的配基，也为粘附分子配基提供了更多的粘附位点，二者相辅相成，促进血小板的进一步激活。上述变化为血小板与肿瘤细胞的相互作用，血小板、肿瘤细胞与内皮和内皮下基质的相互作用提供了良好的物质条件，促进肿瘤细胞的转移。此项结果对解释肿瘤患者的临床现象，为临床治疗提供了实验依据。
1．4 学术界的反映和引用发表论文：肿瘤患者与正常人血小板表面粘附蛋白表达异同的临床观察及意义 中华肿瘤杂志 1997，20（2）：84，为美国权威文摘刊物《生物文摘》摘录收藏，并存入只读光盘数据库ＢＡ《生物文摘》，参加1999年癌症预防和治疗生物学国际研讨会，全国第二届中青年肿瘤学会议。引用情况：文献引文检索显示该文被他人引用5次。1/5 P-选择素及其配体与肿瘤转移关系的研究进展/余耀//中国癌症杂志．-2000，1O（5）：443-445，2/5流式细胞术分析血小板膜糖蛋白及其临床应用/刘长剑//医师进修杂志．－1999，22（12）：49-513/5血小板粘附分子在肿瘤转移中的作用/郑玲//上海铁道大学学报．－1999， 2O（11）：4/5 Platelets promote the adhesion of human hepatoma cells with a highly metastatic potential to extracellular matrix protein: involvement of platelet P-selectin and GP Iib-IIIa/Yu Y; Zhou X D; Liu Y K; et al.//Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. -2002,128(5):2835/5 Does renal carcinoma affect the expression of P-selectin onplatelets?/Mantur M; Kemona H; Pietruczuk M; et al.//Neoplasma. -2002,49(4):243
2．中晚期肺癌患者血小板表面抗原表达及与血瘀证相关临床症状的观察
2．1 主要研究内容及研究方法采用荧光标记的单克隆抗体，首次采用流式细胞术对74例肺癌患者血小板粘附分子CD9、CD31、CD41、CD42a、CD36、TSP、 CD62、CD63的表达进行了检测；用放射免疫的方法对其中30例中晚期肺癌患者血浆中花生四烯酸代谢产物TXB2和前列环素的代谢产物6-酮-PGF1a的含量进行了检测；对此30例中晚期肺癌患者与血瘀证相关的临床症状进行了统计。
2．2 主要研究成果中晚期肺癌患者血小板粘附分子的表达和激活明显加强，与我们所做的较大样本各病种肿瘤患者的研究结果基本一致；与正常人相比，中晚期肺癌患者血浆中花生四烯酸代谢产物TXB2 和前列环素的代谢产物6-酮-PGF1a的含量增加，TXB2/6-酮-PGF1a的比值上升；对30例拥有可测量瘤灶的中晚期肺癌患者与血瘀证相关的临床症状观察显示，出现疼痛者20例，占66.67%，血栓者3例占10%，舌瘀斑者5例，占16.67%，紫暗舌者15例，占50%，青紫舌者5例，占16.67%，血小板>30万者7例，占23.33%。
2．3 研究成果的科学意义和应用前景此研究结果同样从分子水平说明肺癌患者血瘀证的存在，为今后肺癌的治疗和新药的开发提供科学依据。
2．4 学术界的反映和引用发表文章：肺瘤平二号对中晚期肺癌患者血小板表面糖蛋白表达的影响 中国中西医结合杂志 2000，20（1）：32，参加1999年北京肿瘤学术年会。肺瘤平二号膏对肺癌宿主血浆中TXB2和6-酮-PGF1a水平的影响 中国中西医结合外科杂志 2000，6（2）：3
3．流式细胞术对不同肿瘤细胞表面所表达粘附蛋白的检测
3．1 主要研究内容及研究方法采用荧光标记的单克隆抗体，用流式细胞术检测11种人恶性肿瘤细胞[包括高转移人肺巨细胞癌（PGCL3）、低转移人肺腺癌（PAa）、高转移人前列腺癌（PG-3M）、低转移人前列腺癌（PG-3）、人食管癌（Escl）、人肝癌（Bel ）、人结肠癌（HCT）、人鼻咽癌（KB）、人卵巢癌（A2780）、人胃粘液腺癌（MGC803）、人子宫癌（CC801）] 表面血小板免疫相关抗原 CD9、CD31、CD41、CD42a、CD42b、CD61、CD62、CD63、TSP和CD36（凝血酶敏感蛋白受体）的表达情况。这是第一次同时采用这麽多血小板单抗同时对多达11种恶性肿瘤细胞系的细胞进行检测。利用Boyden小室的肿瘤侵袭模型，观察了CD9、CD42a、CD63和TSP单抗对人高转移肺巨细胞癌PGCL3细胞侵袭能力的影响。尚未检索到类似上述研究的报告。
3．2 主要研究成果
3．2．1 发现全部11种人恶性肿瘤细胞表面普遍表达血小板免疫相关抗原CD9、CD42a、CD63、TSP，胃癌细胞MGC803还表达CD36（凝血酶敏感蛋白受体），未发现血小板免疫相关抗原CD31、CD41、CD61、CD42b和CD62的表达。其中对CD42a在肿瘤细胞表面有表达，CD63在不同肿瘤细胞表面表达具普遍性的发现在国内外还是第一次报告。
3．2．2 11种人恶性肿瘤细胞系CD9、CD42a、CD63、TSP和CD36阳性细胞的比例不同，表达的荧光强度也不同，表明肿瘤细胞异质性的存在。
3．2．3 在对二组不同转移能力的细胞系，PGCL3/PAa和PG-3M/PG-3的检测中发现，高转移和低转移能力的细胞系在CD9+、CD42a+、CD63+、TSP+细胞的数目上和/或表达的荧光强度上有较为明显的不同，高、低转移细胞系各自有着基本类似的表达趋势，即CD9+细胞在低转移细胞系有较高的表达；CD42a、TSP有相对低的表达；CD63的表达在高低转移能力不同的二对细胞系有所不同，在低转移细胞系PAa CD63的表达要比高转移细胞系PGCL3低，但低转移PG-3细胞系CD63的表达要比高转移细胞系PG-3M高。在阳性细胞的比例上，CD42a+细胞比例在高转移的PGCL3和PG-3M细胞系均要高于低转移的PAa和 PG-3；CD9+细胞数虽然在高转移细胞系PGCL3和PG-3M分别略低于PAa和PG-3，但没有特别明显的差别；TSP+细胞数在高转移细胞系PGCL3和PG-3M分别明显高于低转移的PAa和PG-3细胞系；CD63+细胞的数目在PGCL3和PAa之间没有不同，但在二个前列腺癌细胞系当中，高转移的PG-3M要比低转移的PG-3高很多。我们在人胃癌细胞系MGC803细胞上发现有CD36的表达，而在其余10种被检测的肿瘤细胞系则未发现表达。
3．2．4 抗CD9单抗处理PGCL3细胞导致细胞侵袭能力的明显增强，而以抗CD42a、TSP和CD63抗体处理的PGCL3细胞的侵袭能力有不同程度下降。
3．3 研究成果的科学意义和应用前景11种人恶性肿瘤细胞系CD9、CD42a、CD63、TSP和CD36阳性细胞的比例不同，表达的荧光强度也不同，表明肿瘤细胞异质性的存在。综合人高低转移癌系对CD9、CD42a、CD63、TSP表达的差异，及抗CD9、CD42a、CD63、TSP抗体处理后PGCL3细胞的浸润小室
4．2．2 PGCL3、PAa细胞与血小板相互作用后穿膜细胞的速度和数量明显加强，低转移细胞系PAa细胞似乎比高转移细胞系PGCL3细胞增加的还要明显。川芎嗪、丹参酮IIA、水蛭素可在不同程度上抑制PGCL3细胞的侵袭，和被血小板明显加强的PGCL3细胞的侵袭过程，凝血酶对这二个过程都起促进作用。
4．2．3流式细胞术的检查显示，川芎嗪可使PGCL3细胞表面表达的血小板免疫相关抗原CD9+、CD42a+、TSP+细胞的数目减少，还可使肿瘤细胞表面表达的CD9荧光强度下降，但它对CD42a和TSP的荧光强度则无影响。川芎嗪对CD63没有明显影响；丹参酮IIA使CD9表达的荧光强度轻度上升，使CD63的荧光轻度下降，但对二者阳性的细胞数目无明显影响。丹参酮IIA可使CD42a+、TSP+的细胞数目下降，减弱CD42a的表达，但对TSP的荧光表达无明显影响；水蛭素在较大剂量时才使CD9的表达有所减弱，可使CD63+、CD42a+细胞的比例下降，并使CD63和CD42a的表达有所减弱。水蛭素对TSP无明显影响；凝血酶使CD9的表达有所减弱，还使CD42a+的细胞数目减少，荧光强度下降，它对CD63和TSP的表达均无明显影响。
4．3 研究成果的科学意义和应用前景没有检索到利用包被纤维粘连蛋白的细胞培养板和浸润小室模型观察川芎嗪、丹参酮IIA和水蛭素对肿瘤细胞粘附和侵袭能力影响的报告。也没有检索到川芎嗪、丹参酮IIA、水蛭素和凝血酶对肿瘤细胞表达的血小板免疫相关抗原CD9、CD42a、CD63和TSP影响的报告。综合上述研究，活血药对肿瘤细胞的作用比较复杂，促粘附与去粘附的影响因素并存，但不能简单认为促粘附或去粘附的增强或减弱何利何弊，需将此诸种因素摆放到活体侵袭转移的整体过程这个背景下进行分析，以得出更准确的结论。活血药成分十分复杂，它们不仅对血液系统有作用，对肿瘤细胞也有相当大的影响，作用位点和作用机制各有不同。就目前研究状况而言，对活血药在临床上的广泛应用仍应采取相对慎重的态度。上述课题还需进行更加深入的研究。4．4 学术界的反映和引用发表文章：活血药对人肺癌细胞粘附和侵袭的影响 中国中西医结合杂志 1999，19（2）：103；血瘀证与恶性肿瘤 中国中西医结合外科杂志 1998，4（6）：378；不同药物对人肺巨细胞癌PGCL3细胞表达的血小板免疫相关抗原的影响 中草药 1999，3O（5）：352引用情况：国内文献引文检索显示"活血药对人肺癌细胞粘附和侵袭的影响"被他人引用1次1/1丹参药理研究进展/张兴//基层中药杂志．－2000，14（4）：47-48国内文献引文检索显示"不同药物对人肺巨细胞癌PGCL3细胞表达的血小板免疫相关抗原的影响" 被他人引用1次1/1川芎嗪的药理作用与临床应用研究进展/郭春燕，李振良//医学综述．－2OO1，7（7）：436-437
5．川芎嗪、丹参及水蛭注射液对人肺巨细胞癌在裸小鼠体内抑制肿瘤生长和转移的实验观察
5．1 主要研究内容及研究方法观察临床常用活血药川芎嗪、丹参和水蛭注射液对人肺巨细胞癌（PGCL3）在BALB/C裸小鼠体内生长和转移的影响。采用川芎嗪注射液，连续注射43天次，每次分别依10ml（200mg）、5ml（100mg）、2.5ml（50mg）/kg体重给药；丹参注射液，连续注射47天次，每次分别依30ml（45g丹参）、15ml（22.5g丹参）、7.5ml（11.25g丹参）/kg体重给药；水蛭注射液，连续注射48天次，每次分别依30ml（75mg）、15ml（37.5mg）、7.5ml（18.75mg）/kg体重给药。实验结束后观察肿瘤移植潜伏期，瘤宿主给药前后体重改变，肿瘤生长曲线，瘤重抑制率，转移抑制率等。
5．2 主要研究成果各注射液在本实验条件下对肿瘤潜伏期和肿瘤生长无明显影响。水蛭注射液低剂量组可能对肿瘤有一定抑制作用。高剂量组和中剂量组川芎嗪注射液的转移抑制率达33%。
5．3 研究成果的科学意义和应用前景活血药在临床上应用是否会促进肿瘤的生长和转移已争论多年，却一直未有定论，本实验结果在一定程度上对此问题进行了解释。三种注射液对肿瘤的生长没有促进作用，水蛭注射液低剂量组可能有一定的抑瘤作用，但须进一步验证。川芎嗪注射液高、中剂量组对肿瘤的转移有一定的抑制作用，与既往的实验结论有相似之处。在本实验条件下，未发现此三种注射液对肿瘤的转移有促进作用。为今后对临床上活血药的应用提供了一定的实验依据。
5．4 学术界的反映和引用川芎嗪、丹参及水蛭注射液对人肺巨细胞癌在裸小鼠体内抑制肿瘤生长和转移的实验观察 中国中西医结合杂志 发表中 |
| 鉴定意见： |
本课题根据中医传统活血化瘀理论，并结合现代医学对肿瘤转移的认识，采用流式细胞术对 181 例实体肿瘤患者和50例健康受试者血小板表面表达的粘附分子，以及11种人肿瘤细胞表达的血小板免疫相关抗原 CD9、CD31、CD36、TSP、CD41、CD42a、CD42b、CD61、CD62 和 CD63 进行了检测。首次发现CD42a 在肿瘤细胞表面有表达，并发现CD63 在不同肿瘤细胞表面的表达具普遍性，这对于进一步深入探讨和认识血小板活化和肿瘤转移的关系具有重要意义。应用细胞模型观察了川芎嗪、丹参酮IIA和水蛭素对肿瘤细胞粘附力和侵袭力的作用，发现三种活血药单体对肿瘤细胞的粘附力和侵袭力均具有不同程度的抑制作用；进而应用人肺癌裸小鼠移植瘤模型观察了三种活血药单体对肿瘤转移的作用，发现其对肿瘤的肺转移率具有一定的抑制作用。本研究科学性和创新性强，具有中医特色，处于国内领先水平。利用血小板与肿瘤细胞相互作用后的促转移协同作用原理，从分子水平分析和探讨了肿瘤转移的"血瘀证"本质和三种活血药的作用机理，对川芎嗪、丹参酮IIA、丹参和水蛭素的临床应用具有重要参考意义。
建议：进一步结合临床，深入研究活血药在临床肿瘤治疗中的应用。 |